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摘要
这篇文章的实验通过行为测试、电生理记录、嗅觉感受器特性和现场实验，发现4-乙烯甲醚（4VA）是能够诱导蝗虫聚集的一种信息素。尽管这种信息素只会当蝗虫形成聚集时特异性释放，但当4，5个单独的蝗虫凑到一起时也会释放4VA，它会特异性的从蝗虫触角上释放。作者同时鉴定到OR35时4VA的特异性嗅觉接收器。用CRISPR-Cas9敲除OR35后，明显降低了触须对于4VA的电生理学反应，最后进行实地实验验证4VA的吸引性。
实验结果
1.蝗虫被4VA吸引
在作者鉴定的35种挥发性物质中，发现了六种化合物:苯乙腈、苯乙醛、4-乙烯醚(4VA)、2,5-二甲基吡嗪、苯乙醇和苯甲醚。它们在蝗虫群体中的释放量显著高于单独的蝗虫（如图1a）（用矿物油做对照）。
图14VA对迁徙的蝗虫表现出强烈的吸引作用；
a：聚集蝗虫和单独蝗虫体内的苯乙腈(PAN)、苯乙醛(BA)、4-乙烯苯甲醚(4VA)、2,5-二甲基吡嗪(DP)、苯乙醇(PhA)和苯甲醚(AS)含量；
b：蝗虫在可选择的两种环境下的行为追踪设置（矿物油为对照）；
c：蝗虫对于六种组分的反应，每个设置中蝗虫的数量n分别为n=30(PAN),28(BA),34(4VA),33(DP),32(PhA),34(AS)
使用双向选择的平台，根据蝗虫在每个区域移动的总时间和距离来评估蝗虫的偏好(图1b)，发现只有4VA对其有明显的吸引作用，而苯乙腈对其有排斥作用（图1c，图1a）。
然后用相同的测定方法，作者根据猜想测定愈创木酚,苯酚,邻二甲氧基苯这三种挥发性物质及其混合物对蝗虫的行为影响，其中愈创木酚表现出了对聚集行为的抑制作用，苯酚和邻二甲氧基苯的混合物也对聚集行为表现出抑制作用。
2.4VA对不同年龄段和性别蝗虫的诱导作用
用4VA对三个生长阶段（G3、G4、G5）的蝗虫幼虫以及成虫进行诱导实验，都表现出了很明显的诱导作用（尤其是刚蜕皮时）。当4VA的浓度在0.5-ng/ul时效果最好。蝗虫对4VA的诱导并没有表现出性别特异性。单独的蝗虫和群体中的蝗虫对4VA的诱导作用表现出的行为是相同的。
3.4VA的含量
4VA在蝗虫中的含量如图2a，4VA几乎在身体的各个组织都能检测到，然后储存在背板和后腿里。4VA含量随年龄增加，在蜕皮后的24h时4VA含量达到最高，含量与性别没关系（如图2b）。
图2根据密度而释放4VA，利用锥形感受器诱导蝗虫发生聚集反应；
a：蝗虫体内和粪便中4VA的色谱分析图；
b：不同性别蝗虫幼虫G1期到G5期的4VA释放量
4.4VA对群体数量变化的响应
4VA随着群体数量的增多而增加（如图2c），为了验证4VA释放的最低条件，将不同密度的蝗虫进行实验，发现最少4，5个蝗虫被放在笼子里（如图2d）时会开始释放4VA。
图2根据密度而释放4VA，利用锥形感受器诱导蝗虫发生聚集反应；
c：不同种群密度下4VA的释放量有显著差异；
d：4VA的释放量随数量的变化
表4.2南极虾聚集的可能原因
5.4VA锥形感受器
为了检测到底是哪个感受器接收了4VA信号，对这些感受器（锥形、刺形、腔锥形、毛型）逐个进行了实验，发现锥形感受器效果最好（如图2e），用与行为实验相同的浓度梯度(0.05—5,ng/μl)进行实验发现锥形感受器对4VA的浓度有效应曲线（如图2f）。
图2根据密度而释放4VA，利用锥形感受器诱导蝗虫发生聚集反应；
e：四种接收器在4VA情况下的运动情况；
f：聚集和单个情况下，圆锥接收器对不同浓度4VA的运动（字母法表示显著性）
6.4VA诱导作用是由OR35基因赋予的
测试青蛙卵母细胞的31个嗅觉感受器对28种气味的电生理学反应，在气味-受体基质中，OR35对4VA的反应最强（如图3a），在蝗虫中也是这样。
图3OR35基因调节4VA对蝗虫的吸引力；
a：用28个种气体对31个气味感受器进行实验，每种情况用n=7个青蛙卵母细胞
作者使用组织免疫学方法来确定OR35的位置，发现OR35在蝗虫的触须上（如附加图3a，b），根据CRISPR-Cas9的方法使用sgRNA去除Or35基因第一个外显子的两个碱基，使OR35蛋白截短（见附加图4a-d）。与正常相比，敲除后对4VA的反应明显降低（见图3b以及附加图4e，f）。
附加图3OR35在蝗虫大部分的器官中都有；
a：共聚焦显微镜下OR35的图片，Bright表示亮视野显微镜，NC表示阴性对照；
b：在总共的53个锥形触须中，50个触须（红箭头标出）都很明显，只有三个不明显（白箭头标出）；
附加图4OR35突变系中纯合子的产生
a：在DNA水平检测到5种Or35突变
b：在mRNA水平上检测到了两个碱基缺失的突变
c：用CRISPR-Cas9制造OR35突变的蝗虫
d：筛选获得二碱基突变的纯合子的示意图。
e：与野生型相比，突变株的OR35蛋白水平显著降低。
7.实际现场中4VA对蝗虫的吸引力
为了验证4VA的作用，在草地放置20组4mg的4VA和20组CH2Cl2进行实验，释放蝗虫看它往哪边走（如附加图5a）最终有80%的蝗虫飞向了4VA（如附加图5b）。然后用粘板做户外测试（如附加图5c），12h后，有26个蝗虫被引向4VA，3个被引向对照，无性格偏向性（如附加图5d）。
附加图54VA诱导蝗虫飞向人工诱饵；
a：二选择人工诱饵；
b：蝗虫更倾向于飞向4VA的区域；
c：人工陷阱实验的设计思路；
d：蝗虫在4VA陷阱板上被捕获的更多
然后在蝗虫自然繁殖地采取了多种实验方法，试验地根据地形和植被选择，并将当地的蝗虫密度进行定量。（如图4，a）。
图4用4VA吸引自然环境的蝗虫；
a：实地陷阱实验的原理图
根据线性模型：数量∝（正比于）处理数*实验区数*蝗虫密度，计算发现背景蝗虫密度没有影响4VA的效果，于是改进了新的线性模型：数量∝处理数+区块数（见图7），这样区块（占2.16%）和处理（占7.87%）都能对计数产生明显影响。4VA的回归曲线高于对照。
8.结论
之前有报道过说4VA对蝗虫和植物有用，但对其他动物没有研究，且这么多物质里只有4VA对蝗虫有诱导作用，说明4VA是特异针对蝗虫的。
4VA还可以用来测量这一片地区的蝗虫数量，来提前预告蝗虫爆发。
4VA释放的很少，所以以前的实验仪器精度可能检测不到。
实验方法
1.挥发性物质的收集与化学分析
采用静态固相微萃取(SPME)收集挥发性物质，在有盖的玻璃瓶中放置蝗虫，插管进去收集。用-GC+TQ+DB-1MS串联的柱子进行分析，GS串联的MS里离子轰击温度为℃，用氩气轰击，压强为2Torr，氦气流速为1ml/min。用不同的标准品做外标。
4VA是通过溶剂提取来的。将组织放到管里加入超滤的水，用电拄匀质。角质组织在液氮中匀质。加入己烷和四甲基苯乙腈作为内标。
2.单感受器的检测
将蝗虫用蜡固定住，把钨丝用10%的NaNO2电镀磨尖，在显微镜下将接收电极插到蝗虫的屁股里（1~4个腿长处），参比电极插到眼睛处，将接收电级连接到信号放大器，将化学物质用矿物油稀释后再做实验，矿物油单独作为空白对照。
3.OR在青蛙卵母细胞中的表达及电信号的检测
将青蛙在冰水中麻醉30min获取卵母细胞，卵母细胞在18℃下孵化2周，用显微注射法注入25ngOrcRNA和25ngOrcocRNA，然后再在18℃的Ringer缓冲液中培养2天，并添加抗生素和血清。采用双电极电压钳技术记录全细胞电流。用双电极电压钳放大信号。
思考
文中提到了一些有机物大分子具有诱导作用，这些诱导物能否对水母或者广泛的动物产生诱导作用还未知。
在做水母的诱导实验时，也要对不同生长阶段的水螅体、碟状体、成体进行实验。进行实地实验时需要根据当地水母的密度来估算信息素的诱导作用，海洋中水母密度测量方法可以使用视频计数。
需要进一步阅读关于水母感受刺激的文章以开展实验路线的设计。需要学习基因敲除以及动物细胞培养的细节操作。
题目：
4-Vinylanisoleisanaggregationpheromoneinlocusts
年份：
期刊：
Nature
作者所属机构：
中国科学院动物研究所，病虫害鼠害综合治理国家重点实验室；
中国科学院大学，生物互作卓越创新中心；
中国科学院大学，北京生命科学研究院；
河北大学，生命科学学院。
原文链接：
